Проводка — процесс дегидратации (обезвоживания) и обезжиривания фрагмента ткани и пропитки его парафином. Другими словами, жидкостная и жировая составляющая ткани замещается парафином. Для приготовления тонких гистологических срезов объекты уплотняют с помощью заливки в парафин, а поскольку он в воде не растворяется, кусочки фиксированной ткани предварительно необходимо обезводить[1].
Значение проводки
Проводка обеспечивает уплотнение ткани, которое необходимо для получения срезов (если ткань будет излишне мягкой, то при микротомировании она будет «сминаться», образуя складки, разрывы и другие артефакты, делающие её непригодной к изучению). Является необходимым этапом подготовки микроскопического препарата и в большинстве случаев — наиболее долгим.[2]Проводка осуществляется путем погружения и инкубацией образцов тканей в спиртах и органических растворителях, в результате чего происходит замещение полярных компонентов ткани (воды) на менее полярные спирты и неполярные углеводороды. Дальнейшее замещение углеводородов на парафин позволяет обеспечить уплотнение образца, что делает возможным получить достаточно тонкие срезы (4-6 мкм) при микротомировании[3].
Методики проводки
Дегидратация и обезжиривание
Для обезвоживания обычно служит набор (или батарея) спиртов повышающейся концентрации[1].
- Проводка с этиловым спиртом и ксилолом
- Проводка с этиловым спиртом и хлороформом
- Проводка с изопропанолом (чаще используют модифицированный изопропиловый спирт с присадками, например, тритоном, обеспечивающим лучшее проникновение реагента в ткани)[4].
- Проводка с использованием толуола, бензола, ацетона и другие кустарные варианты.
В настоящее время эти реагенты ввиду их высокой токсичности для персонала заменяются сочетанием 100% изопропанола и минерального масла[3]. Важной технологической особенностью использования изопропанола является необходимость существенного (до 1,5 раз) увеличение продолжительности проводки материала[5].
Методики обезвоживания отличаются продолжительностью. Значительно ускоряет процесс нагревание спиртов до 37-40 градусов С, кроме того увеличиваются обезжиривающие свойства спиртов, что важно при проводке богатых жирами тканей. Процессы диффузии можно усилить постоянным перемешиванием растворов, например с помощью магнитной мешалки[6].
Пропитка
- Пропитка чистым парафином (в настоящее время не используется, так как парафин застывает с образованием кристаллов и при резке крошится)
- Пропитка парафиновой средой (парафиновой средой называют парафин с присадками — пчелиный, рисовый воск и др.). Может изготавливаться как вручную, путём многократного расплавления и перемешивания до достижения гомогенной массы, так и в заводских условиях.[7]
- Пропитка целлоидином. Метод считается относительно устаревшим, так как пригоден не для всех типов окраски (в том числе иммуногистохимии (ИГХ).
Нельзя превышать температуру парафина выше 62°С, так как некоторые готовые парафиновые смеси содержат полимеры, которые разрушаются от высокой температуры[3]. Для получения наилучших результатов при проводке и заливке материала необходимо использовать парафин высокого качества. В настоящее время предлагается множество марок специализированного гранулированного парафина для гистологии. Основные качественные характеристики – температура плавления 56 градусов С, гомогенность , пластичность[5].
Проводка может производиться как вручную, так и при помощи автоматических процессоров карусельного или вакуумного типов, обеспечивающих смену растворов, необходимую температуру и давление для наилучшей пропитки тканей реагентами[3].
Проводка вручную
Традиционно проводку осуществляли вручную, и в превалирующем количестве российских гистологических лабораторий метод используется до сих пор. Имеет ряд значительных недостатков: трудоемкость, длительность (до четырёх суток), испарение реагентов в воздух лаборатории (что небезопасно для сотрудников лаборатории, так как ксилолы образуют взрывоопасные паровоздушные смеси, вызывают острые и хронические поражения кроветворных органов, при контакте с кожей — дерматиты)[8], а также нестабильное качество получаемой ткани, зависящее от человеческого фактора, а именно действий лаборанта. Кроме того, расход реагентов при проводке вручную намного выше, чем при автоматической, — как за счет испарения, так и за счет меньшей эффективности.
Типичная схема проводки ручным методом[3]:
| 1. | Проточная фильтровальная вода | 30 мин |
| 2. | Изопропанол 1 | 60 мин |
| 3. | Изопропанол 2 | 60 мин |
| 4. | Изопропанол 3 | 60 мин |
| 5. | Изопропанол 4 | 60 мин |
| 6. | Изопропанол 5 | 90 мин |
| 7. | Изопропанол: минеральное масло - 5:1 | 90 мин |
| 8. | Изопропанол: минеральное масло - 2:1 | 90 мин |
| 9. | Минеральное масло | 360 мин |
| 10. | Парафин 1 | 60 мин |
| 11. | Парафин 2 | 60 мин |
| 12. | Парафин 3 | 60 мин |
Автоматическая проводка
Основная статья: Гистопроцессор
Существуют аппараты — гистопроцессоры, имеющие закрытый контур и таким образом не допускающие испарений в воздух лаборатории. Путём использования гистопроцессоров также можно значительно уменьшить время проводки по сравнению с ручным методом (до одного часа при использовании гистопроцессора Donatello Fast) за счет применения вакуум-инфильтрационной методики.
Типичная схема проводки на гистопроцессоре для образцов не более 4 мм[9]:
| 1 | 70% этанол | 15 мин |
| 2 | 90% этанол | 15 мин |
| 3 | 100% этанол | 15 мин |
| 4 | 100% этанол | 15 мин |
| 5 | 100% этанол | 30 мин |
| 6 | 100% этанол | 45 мин |
| 7 | Ксилол | 20 мин |
| 8 | Ксилол | 20 мин |
| 9 | Ксилол | 45 мин |
| 10 | Парафин | 30 мин |
| 11 | Парафин | 30 мин |
| 12 | Парафин | 45 мин |
Примечания
- ↑ 1 2 Янин В.Л., Бондаренко О.М., Сазонова Н.А. Учебно-методическое пособие для аспирантов очной формы обучения к практическим занятиям по дисциплине «Методы исследования в цитологии и гистологии». Учебно-методическое пособие / рецензент к.м.н. А.А. Вотинцев. — Ханты-Мансийск: БУ «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия», 2015. — 65 с.
- ↑ Обезвоживание гистологического материала. Дата обращения: 3 октября 2011. Архивировано 17 октября 2014 года.
- ↑ 1 2 3 4 5 М.О. Мавликеев, Архипова С.С., Чернова О.Н., Титова А.А., Певнев Г.О., Шафигуллина А.К., Киясов А.П. Краткий курс гистологической техники. Учебно-методическое пособие / под научной редакцией к. м. н., доцента Р.В. Деева. — Казань: Казанский университет, 2020. — 107 с. — ISBN ББК 28с.
- ↑ Реактивы для проводки " Гистологическое оборудование и расходные материалы " Проводка : BioVitrum. Дата обращения: 3 октября 2011. Архивировано из оригинала 1 августа 2010 года.
- ↑ 1 2 Основы обеспечения качества в гистологической лабораторной технике: Руководство / Под ред. П.Г.Малькова, Г.А.Франка. — М., 2011. — 108 с. — ISBN 978-5-91366-251-4.
- ↑ Семченко В.В., Барашкова С.А., Ноздрин В.Н., Артемьев В.Н.,. Гистологическая техника: учебное пособие. — 3-е изд. — Омск-Орел: Омская областная типография, 2006. — 290 с. — ISBN 5-87367-025-0.
- ↑ Histomix. Дата обращения: 3 октября 2011. Архивировано из оригинала 2 апреля 2012 года.
- ↑ [bse.sci-lib.com/article066904.html Ксилолы] — статья из Большой советской энциклопедии (3-е издание)
- ↑ Tissue Processing Overview: Steps & Techniques for Histopathology. www.leicabiosystems.com. Дата обращения: 27 апреля 2024.
| Методы гистологии | |
|---|---|
| Связанные статьи | |
Эта страница в последний раз была отредактирована 27 апреля 2024 в 09:38.
Обычно почти сразу, изредка в течении часа.